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      ELISA相關問題與解答
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      ELISA相關問題與解答

      • 分類:相關知識
      • 作者:
      • 發布時間:2014-10-15 14:40:00

      ELISA相關問題與解答

      • 分類:相關知識
      • 作者:
      • 來源:
      • 發布時間:2014-10-15 14:40
      • 訪問量:70
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      1、ELISA檢測所用的樣本怎樣進行采取和保存?

      解釋:大部分ELISA 檢測均以血清或血漿為樣本。血清樣本可按常規方法采集,應注意避免溶血,紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質,以HRP 為標記的ELISA 測定中,溶血樣本可能會增加非特異性顯色。血清樣本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染,菌體中可能含有內源性HRP,也會產生假陽性反應。一般說來,在5 天內測定的血清樣本可放置于2~8℃,樣本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG 聚合,特別是使得間接法試劑的本底加深;超過一周測定的樣本需-20℃或以下保存,凍結血清融解后,蛋白質局部濃縮,分布不均,應充分混勻并避免產生氣泡?;鞚峄蛴谐恋淼难鍢颖緫入x心或過濾,澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落,所以測抗體的血清樣本如需保存作多次檢測,宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應注意無菌操作,也可加入適當防腐劑??鼓煌耆臉颖疽蚶w維蛋白原的干擾而造成假陽性,建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑。

      2、ELISA檢測時如何保證有效洗滌?

      解釋:洗滌是將特異結合于固相的抗原或抗體與反應溫育過程中吸附的非特異成份分離開來,以保證ELISA測定的特異性。因此,洗板對于ELISA測定來說,是極其關鍵的一環。

      1)  強烈建議使用全自動洗板機洗滌,手工洗滌容易造成交叉污染;

      2)  定期對洗板機進行維護保養,使用前檢查有無堵孔現象,吸液、注液及走板等運行是否正常,一般要求,吸干后每孔的殘留量不超過2ul,注液量每孔大于250ul,但不能漫溢,同時設置一定的浸泡時間,60秒/遍,至少洗滌5遍。

      3、ELISA實驗比色中單波長和雙波長的區別?

      解釋:

      1)中檔以上的酶標儀基本上都同時具有單波長和雙波長比色功能,所謂的單波長測量即選擇對終止后顯黃色的液體具有最大吸收的波長450nm進行比色測定,得到各孔的A值,其中此A值包括了本身液體顏色的吸收值(W1)和非特異吸收值(W2),非特異吸收值一般值板孔及孔底上指紋、刮痕、灰塵等臟物吸收值,則W1=A-W2,我們比色時設置空白調零,就是把其作為非特異吸收值進行相減,其實并不是每個孔的非特異吸附值都是一樣的,故單波長測量有一定程度的不確定性,也就是說空白孔位置不同均有可能得到不同吸光度值,只是在可接受范圍內。

      2)而波長雙色則酶標儀在敏感波長450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次,敏感波長的吸光度測定值為特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和(M1);非敏感波長下測定,此時特異顯色的吸光度值為零,而測得的吸光度即為臟物的吸光度值(M2),最后酶標儀給出的數值為敏感波長下的吸光度值與非常感波長下的吸光度值的差(A=M1-M2), 故而在測定比色時,最好是使用雙波長比色。

      3)選擇雙波長比色時不必設空白孔調零,若仍設空白孔調零比色,就有可能會出現吸光度為負數的現象。

      4、ELISA檢測試劑敏感度偏低的處理方法?

      解釋:    

      1) 重新實驗,并在實驗中注意試劑盒的溫度平衡、溫育的時間、顯色的時間等影響因素的控制;

      2) 檢查質控品是否有反復凍融的情況、質控品是否有批內差異、質控品是否為2~8℃久置;

      4) 重新評估質控品的可靠性;

      5) 樣本本身由于各種因素影響而表現為弱陽性,實際上為陰性樣本;

      6) 由于樣本自身含量較低,易隨實驗水平波動。對這部分樣本的處理應格外慎重,有條件的用戶應進行確證實驗;

      7) 注意檢查實驗中所用的儀器設備是否定期校準;

      8) 注意檢查實驗中所用的板、酶標試劑批號是否相同,不同批號試劑不得混用。


      5、ELISA產品檢測時,出現本底偏高或者“花板”現象的主要原因分析?

      解釋:

      洗滌原因:

      1)各個廠家使用的洗滌液配方根據各自試劑的條件配制的,采用不配套的洗液常達不到正常的洗滌結果,主要會造成本底過高,甚至出現花板現象。本公司的洗滌系統不建議和其它公司的試劑盒混用。

      2)配置洗液的水應該采用新鮮的蒸餾水或去離子水,倘若使用自來水,水中含有過多的Ca2+、Mg2+,這些離子會占用表面活性劑,影響洗滌效果,同時水中一些微生物釋放的內源性物質會造成干擾,出現過高的非特異性反應。

      3)洗板時,應保證洗板機的每孔注液量和吸液殘留量正常方可使用,否則影響洗滌效果,一般注液量要求在300~350μl/孔,但不應溢出,避免交叉污染,吸液殘留量≤2μl,至少洗滌5遍。

      顯色系統原因:

      1)底物B液已微變色造成本底偏高。

      2)反復使用的槍頭、加樣槽清洗不當,也會干擾,使得底物A、B液發生非特異反應。

      樣本自身原因:

      1)使用了溶血樣本,紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質,會增加非特異性顯色;血清樣本比較陳舊,如有細菌污染,菌體中可能含有內源性HRP,也會增加非特異性顯色。

      2)使用了抗凝不完全的樣本,因纖維蛋白原的干擾而造成非特異性顯色,建議盡量不用抗凝血,尤其是肝素抗凝樣本。

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